Dados do Trabalho

Título

O SILENCIAMENTO GÊNICO DAS RHO GTPASES RhoA E RhoC ALTERA A PROLIFERAÇÃO, MIGRAÇÃO, CONTRAÇÃO E ADESÃO DE CÉLULAS LEUCÊMICAS

Introdução

A leucemia mieloide aguda (LMA) é a principal leucemia em adultos, caracterizada pelo acúmulo de blastos (células indiferenciadas com alto potencial proliferativo) na medula óssea. A heterogeneidade clínico-molecular da doença está associada a inespecificidade do tratamento e baixas taxas de sobrevida. Proteínas Rho GTPases regulam processos celulares como proliferação, migração e adesão. Resultados de nosso grupo demonstraram que a expressão das Rho GTPases RhoA e RhoC está desregulada em LMA. Porém, suas funções ainda não foram elucidadas nesta doença.

Objetivo

Neste estudo, avaliamos os efeitos do silenciamento de RhoA e RhoC na morfologia, proliferação, migração e adesão de células mieloides.

Métodos

A linhagem celular leucêmica mieloide U937 foi silenciada para RhoA (shRhoA) ou RhoC (shRhoC) com lentivírus e a efetividade do silenciamento gênico foi avaliada por Western Blotting. O crescimento celular foi analisado por contagem em câmara de Neubauer. A morfologia celular foi avaliada por microscopia de contraste de fase, microscopia confocal (MC) (marcação com faloidina e tubulina) e microscopia eletrônica de transmissão (ME). A migração celular foi avaliada em placas de transwell (análise quantitativa) e por microscopia time-lapse (análise qualitativa). Ensaios de adesão celular estática e sob condições de fluxo contínuo, combinado com imagens em tempo real, também foram realizados.

Resultados

O silenciamento de RhoA e RhoC foi efetivo em células U937 com redução de 80% na expressão das respectivas proteínas em comparação com as células controle (shCTRL). Células shRhoA ou shRhoC apresentaram evidentes alterações morfológicas. Por MC notamos, em shRhoA, longas projeções de actina e células multinucleadas, já as shRhoC apresentaram morfologia mais arredondada com um urópode posterior, enquanto as shCTRL se mostraram mais arredondadas e uniformes, com ausência de projeções citoplasmáticas. Por ME observamos a presença de projeções membranares longas e finas em shRhoA e projeções mais curtas em shRhoC, já as shCTRL não apresentaram projeções de membrana. A inibição de RhoA e RhoC também resultou na redução da proliferação celular de 70 e 25%, respectivamente (P<0,05). A migração de shRhoA e shRhoC diminuiu 40% (P<0,001). Adicionalmente, observamos diminuição da contratilidade das shRhoA e shRhoC comparadas às shCTRL. Houve redução de 95% na adesão estática de shRhoA e shRhoC em fibronectina (P<0,001). A análise da adesão em fluxo revelou diminuição de 82% (P<0,001) e 15% (P<0,05) na adesão de shRhoA e shRhoC à Poli-L-Lisina em comparação a shCTRL.

Conclusões

Nossos resultados indicam que as proteínas RhoA e RhoC estão relacionadas aos processos de proliferação, migração e adesão de células leucêmicas, por meio do controle do citoesqueleto. Apesar de homólogas, estas Rho GTPases apresentam papéis distintos na morfologia celular, especialmente no rearranjo das fibras de actina e tubulina. Todas estas atividades celulares estão desreguladas em neoplasias hematológicas e nosso trabalho mostra, de forma inédita, o envolvimento de RhoA e RhoC na LMA.

Palavras-chave

Leucemia mieloide aguda, Rho GTPases, RhoA

Financiador do resumo

CAPES, FAPESP (2022/03171-0)