Dados do Trabalho

Título

Validação Funcional de Variantes de Significado Incerto em CHEK2

Introdução

O gene CHEK2 é um dos genes associados à predisposição hereditária ao câncer, principalmente de mama e colorretal, compreendendo os 5 a 10% dos casos caracterizados por mutações na linhagem germinativa. Esse gene codifica uma quinase de ciclo celular com papel importante na resposta a danos ao DNA, ao fosforilar e ativar proteínas envolvidas neste processo. Inúmeras variantes nesse gene ainda não foram classificadas como relacionadas ou não ao desenvolvimento do câncer, sendo consideradas VUS (Variantes de Significado Incerto).

Objetivo

Selecionar VUS de interesse a partir de banco de dados do ACCCC, gerar vetores de expressão das variantes e transfectá-los em células, observando alterações no fenótipo e propriedades cancerosas. Caracterização funcional das VUS para compreensão do risco das variantes e direcionamento de pacientes.

Métodos

As VUS de interesse foram selecionadas a partir do histórico familiar do paciente, a classificação de acordo com o ClinVar, o índice Revel na plataforma Franklin Genoox (maior que 0,45) e a existência de trabalhos similares. O experimento de Western blotting foi feito com o anticorpo Chk2 (Santa Cruz) e um secundário anti-mouse (GE Healthcare), para avaliar a expressão do gene em 500.000 células MDA-MB-436. Uma curva de crescimento com células MDA-MB-436 transfectadas com BRCA1 ou GFP e tratadas com soro ou carenciadas foi realizada, com 50.000 células para cada condição. O plasmídeo PDON223_CHEK2 (Addgene) não pode ser transfectado diretamente na célula, e ele será inserido no plasmídeo pEGFP-C1 (Clontech). Foi realizada uma PCR convencional com o kit GoTaq Promega para inserir sítios de enzimas de restrição do GFP (EcoRI e SalI) pelos primers na sequência de CHEK2, para posteriormente realizar a digestão enzimática e gerar um plasmídeo GFP com a sequência do gene de interesse.

Resultados

As variantes escolhidas foram as missense c.1036C>T, c.962A>C, c.1427C>T e c.427 C>T. Os controles positivos escolhidos foram variantes missense reconhecidamente patogênicas, c.349 A>G e c. 49 G>T, e os negativos foram variantes sabidamente benignas, c.1343 T>G e c.254 C>T. O Western blotting revelou a expressão normal do gene CHEK2 em células MDA-MB-436, pela banda de proteína de 66 kDa identificada. A curva de crescimento sugere que as células tratadas com soro fetal bovino e transfectadas com BRCA1 cresceram ligeiramente mais do que as transfectadas com GFP, ao passo que as carenciadas, em ambas as transfecções, se mantiveram praticamente no valor do primeiro dia após o plaqueamento. A reação de PCR realizada gerou como produto um fragmento de 1645 pares de bases, que corresponde à sequência do gene CHEK2 com enzimas de restrição que possibilitarão sua inserção no plasmídeo GFP.

Conclusões

Conclui-se que a atividade de CHK2 em células MDA-MB-436 é normal no ciclo celular. Os próximos passos compreendem a geração de um plasmídeo com a sequência de CHEK2 que possa ser transfectado, a construção de vetores mutantes por uso de kit de mutagênese sítio dirigida e a transfecção desses plasmídeos nas células. Para analisar o possível fenótipo tumorigênico, serão realizados ensaios de Soft agar e MTT, além da análise do ciclo celular por citometria de fluxo com iodeto de propídeo.

Palavras-chave

Síndrome de Predisposição Hereditária ao Câncer; Variantes de Significado Incerto; CHEK2