Dados do Trabalho

Título

LncRNA sintético com capacidade de sequestramento de oncomiRNAs em meduloblastoma

Introdução

MiRNAs, RNAs de 18-25 nucleotídeos, desempenham função na regulação pós-transcricional. Em meduloblastoma, a sua desregulação está associada à agressividade tumoral, tornando alvos interessantes para tratamento. Os LncRNAs são transcritos que podem apresentar regulação dos miRNAs através da sua função esponja. Dessa forma, estratégias que se aproveitam dessa função para a construção de esponjas de RNA sintéticas se demonstram promissoras como terapias antineoplásicas.

Objetivo

O objetivo consiste no desenho de um LncRNA sintético, capaz de inibir a ação de miRNAs diferencialmente expressos em meduloblastomas, com foco nos dois subtipos tumorais mais agressivos, pertencentes aos grupo 3 e SHH-activated.

Métodos

Os miRNAs alvos da esponja foram definidos através de um estudo in silico, identificando miRNAs diferencialmente expressos em amostras de pacientes com meduloblastoma.
Definido os miRNAs a serem trabalhados, foi verificado através do qRT-PCR o nível de expressão desses miRNAs em linhagens de meduloblastoma (Subtipo Grupo 3: HDMBO3, Med8A, D341, Subtipo SHH: DAOY, ONS76 e Subtipo Grupo 3/4: D283-med, USP-13 med). Simultaneamente a essa etapa, o desenho do lncRNA sintético (siLncRNA) e o controle scramble (SCR) foram elaborados. As linhagens contendo o siLncRNA e o SCR foram estabelecidas pela transecção com lentivírus e seleção por antibiótico G418, e/ou cell sorting.
Com as linhagens, verificou-se a capacidade de inibição dos miRNAs por qRT-PCR e a diminuição da agressividade tumoral por ensaios de ensaio de migração celular haptotático por transwell, curva de crescimento celularpelo equipamento de Xcelligence e ciclo celular por incorporação de iodeto de propídeo.

Resultados

Foram identificados 43 miRNAs superexpressos em meduloblastomas através da literatura. Desses, selecionou-se 4 para desenvolver siLncRNAs. O perfil destes miRNAs foi avaliado em 7 linhagens, sendo escolhidas as linhagens DAOY, ONS76, USP13 e Med8A. Daoy e ONS76 apresentaram expressão aumentadade de 4/4 miRNAs e 1/4 miRNAs respectivamente. USP13 apresentou 3/4 miRNAs expressos, já Med8A apresentou baixa expressão dos miRNAs alvos. Após a transfecção do siLncRNA (85% de pureza) as células DAOY, ONS76, USP13 e Med8A reduziram significativamente 4/4, 3/4, 3/4 e 1/4 da expressão do 4 miRNAs, respectivamente.
Nos ensaios funcionais, observou-se que as linhagens DAOY e ONS76 apresentaram menor crescimento celular com siLncRNA em comparação com as células controle SCR (Xcelligence). Na migração, a linhagem USP13 teve sua capacidade de migração reduzida com siLncRNA, enquanto ONS76 apresentou aumento. Quanto ao ensaio de ciclo celular, houve aumento na fase G1 em ONS76 e diminuição em USP13.

Conclusões

A expressão dos miRNAs varia entre as 7 linhagens tumorais. Mesmo assim, 4 linhagens contendo os grupos siLncRNA e SCR foram estabelecidas com sucesso, com o sequestro significativo dos miRNAs alvos. Nos ensaios funcionais, as respostas variaram entre as linhagens, refletindo complexidade tumoral.

Palavras-chave

Regulação de miRNAs, Tumores do sistema nervoso central e LncRNAs, esponja de miRNAs.

Financiador do resumo

CAPES - Processo nº 88887.816576/2023-00