Dados do Trabalho

Título

CLONAGEM, EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE TIM-3_ECD-FC EM CÉLULAS HEK293-T COMO ANTÍGENO PARA A SELEÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS IMUNOTERAPÊUTICOS

Introdução

Os checkpoints imunológicos são receptores expressos em células imunes que controlam a resposta imunológica para prevenir imunopatologias, mas que podem participar do escape imunológico, causando disfunções em células T em doenças como o câncer. O bloqueio do checkpoint TIM-3 por anticorpos mostrou sucesso antitumoral. Assim, faz-se necessária a síntese de antígenos de qualidade para a seleção de anticorpos capazes de reverter a exaustão das células T e aumentar a eficácia da imunoterapia.

Objetivo

O presente trabalho tem como objetivo a clonagem, expressão e purificação da molécula de TIM-3 fusionada a porção FC de anticorpos em células HEK293, para servirem de antígenos na seleção de anticorpos monoclonais bloqueadores que serão testados como possíveis imunoterapêuticos.

Métodos

Bactérias DH5a quimiocompetentes foram transformadas com a construção sintética pcDNA3.1-TIM-3_ECD-FC. Clones positivos foram selecionados para crescimento em meio Luria-Bertani (LB) e antibiótico ampicilina. Realizou-se a extração de DNA plasmidial para amplificação da construção, obtendo-se 1942,2 ng/μl de DNA plasmidial purificado.
O DNA plasmidial foi transfectado em células HEK 293-T para expressão transitória da proteína recombinante, realizando-se cromatografia de afinidade com a proteína G do sobrenadante das células para a purificação de TIM-3_ECD-FC. O rendimento da purificação foi de 1,3 mg/L e a análise por SDS-PAGE da proteína recombinante purificada exibiu uma única faixa em ~ 50 kDa, sugerindo alta pureza.
A funcionalidade da proteína foi primeiramente analisada por ELISA indireto, avaliando o reconhecimento do TIM-3-Fc por anticorpos de conformação específica anti-TIM-3 e anti-humano Fc, confirmando o seu adequado estado de dobramento.

Resultados

Nossos resultados parciais demonstram o sucesso da clonagem, expressão e purificação de TIM-3_ECD-FC funcional em células HEK-293T. Análises funcionais para avaliar a capacidade imunomoduladora da molécula estão sendo realizadas para validar a sua funcionalidade. Ademais, a transfecção de células HEK-293 com a construção plasmidial pcDNA3.1-TIM-3-FC está em andamento para estabelecimento de linhagem celular com expressão contínua de TIM-3_ECD-FC.

Conclusões

Apesar dos significativos avanços na pesquisa, o câncer ainda representa uma ameaça à saúde global — até o momento, a resposta imunológica de muitos pacientes a imunoterapia atinge no máximo 40%. A fim de possibilitar a obtenção de anticorpos de alta afinidade e potencial terapêutico que possam aumentar significativamente a eficiência da imunoterapia, produziu-se TIM-3_ECD-FC, cujos testes indicam o adequado estado de dobramento e a funcionalidade da molécula, que será utilizada para seleção de potenciais anticorpos para imunoterapia.

Palavras-chave

TIM-3, IMMUNE CHECKPOINT, IMUNOTERAPIA

Financiador do resumo

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (2022/11876-3)