Dados do Trabalho

Título

Abordagens genômicas para reclassificar variantes de significado clínico incerto não codificantes e de efeito em splice em genes de predisposição hereditária ao câncer

Introdução

Uma significativa parcela dos testes genéticos para investigação de predisposição ao câncer ainda apresenta como resultado a identificação de variantes de significado clínico desconhecido (VUS), o que representa um grande dilema para a prática clínica. O uso de ferramentas genômicas avançadas como o sequenciamento alvo de RNA e novos softwares in silico baseados em machine learning, representam estratégias eficientes para a reclassificação de VUS.

Objetivo

Os objetivos do estudo são: estabelecer um conjunto de ferramentas genômicas e computacionais que permitam a reclassificação de VUS codificantes ou não codificantes com possível efeito em splice (spliceogênicas); validar um painel de captura de RNA de 27 genes de predisposição ao câncer.

Métodos

Para isso, arquivos VCFs de testes genéticos de DNA realizados previamente no Laboratório de Diagnóstico Genômico e em projetos de pesquisa do A.C Camargo que avaliaram de 26 a 126 genes de predisposição hereditária ao câncer foram reavaliados utilizando o software Varseq. Variantes raras exônicas (sinônimas, missenses) e não codificantes (intrônicas até 20 pb do limite do éxon e nas regiões 5’ e 3’ UTR) foram filtradas e avaliadas por ferramentas de predição de splice (MaxEntScan, dbscSNV e SpliceAI) e de impacto na 5’ UTR (UTRannotator). O sequenciamento alvo de RNA (RNAcap) está sendo realizado com pacientes com variantes previstas de alterar splicing, pacientes com variantes patogênicas/provavelmente patogênicas (P/PP) sabidamente spliceogênicas (controle positivo) e indivíduos controles (controle negativo). Os dados gerados serão mapeados e analisados utilizando o software rMATS, para a comparação entre os eventos de splice de cada paciente com o grupo controle utilizando a métrica PSI (percent spliced in).

Resultados

Realizamos a revisão e avaliação in silico dos VCFs de 2.080 pacientes, dos quais 1.954 tiveram pelo menos uma variante rara selecionada em região codificante, região intrônica e/ou região 5’ e 3’ UTR, correspondendo um total de 9.263 variantes totais e 4.804 únicas. Destas, 141 variantes únicas são previstas de afetar splice em pelo menos um preditor, 34 tiveram alguma consequência na região 5’UTR, 850 variantes raras foram identificadas na região 3’UTR. Para a validação do painel RNAcap de 27 genes, 59 pacientes foram identificados com 32 variantes P/PP spliceogênicas únicas , e 43 pacientes com 30 VUS únicas. Foi realizado o sequenciamento de RNAcap com 21 pacientes (8 com variantes P/PP, 7 com VUS e 6 controles). Obteu-se um enriquecimento médio de 35% para as regiões alvo, e a média de cobertura por base 8,961X. O perfil de splicing das amostras está sendo analisado utilizando o software rMATS. Registro do projeto no CEP: n° 3051/21.

Conclusões

Estabelecemos critérios e um pipeline automatizado para a seleção de variantes raras codificantes e não codificantes previstas de alterar splice, sendo identificados 43 pacientes para a etapa de validação do painel de RNAcap e análise de splicing e 9 para avaliação na 5’ UTR. A partir dos dados de RNAcap será avaliada a consequência em transcritos clinicamente relevantes para pacientes com VUS, buscando utilizar os resultados alcançados na reclassificação destas variantes.

Palavras-chave

Câncer hereditário, Análise de RNA, Variantes não codificantes

Financiador do resumo

CAPES e FAPESP