Dados do Trabalho

Título

Deleção de PIMREG afeta o reparo por Recombinação Homóloga em células repórter

Introdução

PIMREG é um marcador de proliferação com expressão aumentada em diversos tipos de câncer, especialmente em glioblastoma (GBM). Nós mostramos recentemente que os níveis do transcrito de PIMREG correlacionam positivamente com a progressão tumoral e a sobrevida de pacientes com gliomas. Ainda, nossos dados sugerem a participação de PIMREG na resposta ao dano ao DNA (DDR), pois o silenciamento de PIMREG inibiu a ativação de ATM nas células de GBM tratas com TMZ.

Objetivo

Investigar a participação de PIMREG no reparo do DNA. Assim, promover o knockout de PIMREG em células repórter para o reparo pela via de Recombinação Homóloga (HR) e avaliar o reparo após indução de quebra de dupla fita nessas células.

Métodos

Para realizar o knockout de PIMREG nas células repórter para HR (U2OS DR-GFP), sgRNAs com alvo no éxon 2 do gene foram clonados em vetor CRISPR/Cas9 (vetor PX458) e transfectados nas células U2OS DR-GFP. Células eficientemente transfectadas (GFP+) foram submetidas a single cell sorting (FACS), cultivadas para expansão de populações monoclonais e testadas para deleção de PIMREG por western blot e sequenciamento do DNA genômico. 4 linhagens knockout foram utilizadas nos ensaios funcionais in vitro que envolviam a quebra de dupla fita no cassete repórter para HR. Essas foram transfectadas com o vetor pCBASceI, que leva à expressão da enzima causadora do dano ao cassete repórter. Em caso de reparo, as células passam a expressar GFP. Assim, a porcentagem de células GFP+, quantificada por citometria de fluxo, reflete os níveis de reparo. Dados de 5 experimentos, feitos em triplicata, foram analisados pelo FlowJoTM. Comparou-se as taxas de reparo dos grupos WT e KO pelo teste ANOVA.

Resultados

Foram gerados 4 vetores CRISPR/Cas9 com 4 sgRNAs distintos com alvo em PIMREG. Para cada construção obteve-se 22, 11, 20 e 25 linhagens monoclonais (KO-1, 2, 3 e 4 PIMREG, respectivamente), das quais 10 foram testadas. Por western blot, foram identificadas 6, 8, 4 e 4 linhagens sem expressão proteica de PIMREG (KO-1, 2, 3 e 4 PIMREG, respectivamente), sendo que um clone de cada foi sequenciado na região do DNA genômico alvo dos sgRNAs. Foram identificadas deleções, inserções e trocas de nucleotídeos, confirmando as alterações gênicas e a introdução de códons de parada prematuro nos 4 clones sequenciados. Os ensaios de reparo por HR demonstraram redução média, estatisticamente significativa, de 18%, 36,4% e 33,3% no reparo por HR nas linhagens KO-1, 3 e 4 PIMREG, respectivamente, quando comparadas com a linhagem WT, enquanto a linhagem KO-2 PIMREG, por outro lado, apresentou uma redução média, sem significância estatística, de 6,9% do reparo.

Conclusões

Vimos que a deleção de PIMREG diminui a capacidade das células repórter em reparar o DNA por HR, sugerindo a participação de PIMREG no reparo de dano. Esses dados trazem uma nova perspectiva aos resultados anteriores do grupo que mostraram que a inibição de PIMREG afeta a sinalização de ATM frente ao dano causado por quimioterápico. Mesmo que ainda não esteja claro se PIMREG participa diretamente no reparo ou na sinalização do dano, os dados se mostram promissores a respeito do seu papel em DDR.

Palavras-chave

PIMREG, DDR, Recombinação Homóloga

Financiador do resumo

Processo FAPESP 2021/06194-8