Dados do Trabalho

Título

Avaliação da resposta antitumoral in vitro de células CAR-T em cultivo com glioblastoma

Introdução

O glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral primário mais comum e agressivo em adultos. Devido a ineficácia do tratamento padrão, a sobrevida média dos pacientes ainda é baixa e o tumor é altamente recorrente. Tal recidiva tumoral é atribuída à presença de células-tronco tumorais (glioma stem cells, GSC). Nesse sentido, a imunoterapia com células CAR-T (Chimeric Antigen Receptor expressed in T-lymphocytes) pode representar uma alternativa terapêutica quando engenheirada para ter efeito antitumoral contra as GSCs.

Objetivo

Este estudo teve como objetivo o desenvolvimento de um CAR capaz de reconhecer dois alvos expressos em GSC (aqui chamados de GSCT2 e GSCT3), expressá-lo em linfócitos-T humanos, caracterizando sua atividade antitumoral in vitro contra linhagens de GBM.

Métodos

Desenvolvemos um receptor quimérico de antígeno de terceira geração capaz de reconhecer dois alvos, GSCT2 e GSCT3, expressos em GSC. Em seguida, avaliamos o nível de expressão gênica basal de ambos os antígenos em diferentes linhagens tumorais por RT-qPCR e validamos sua expressão comparando com dados de sequenciamento de RNA obtidos da literatura. Para a caracterização in vitro das células CAR-T+, transduzimos populações de linfócitos humanos Pan TCD3+ com partículas lentivirais contendo o vetor para expressão do CAR GSCT2/T3 com multiplicidade de infecção = 10. Confirmamos a presença do CAR por RT-qPCR e Western-Blot. Posteriormente, co-cultivamos as células TCD3+CAR+ com linhagens de GBM positivas para a expressão dos alvos, LN18, U138 e U343, e linhagem tumoral de mama com menor expressão, MCF7. Determinamos a porcentagem de citotoxicidade das células CAR+ por meio de ensaio de liberação de LDH e o perfil de citocinas liberadas por meio do ensaio de Multiplex.

Resultados

A análise in vitro e in silico da expressão dos alvos indicou que GSCT2 é, no geral, mais expresso que GSCT3. Ainda, a expressão tanto de GSCT2 quanto GSCT3 é significativamente maior em astrocitomas se comparado a outros tipos tumorais, como tumor de mama. Além disso, confirmamos a expressão gênica e a presença proteica do CAR nas células TCD3+ transduzidas de acordo com o peso molecular esperado (entre 100 e 75 kDa). A citotoxicidade das células TCD3+CAR+ é maior em relação às TCD3+ controle (não transduzidas) quando co-cultivadas com linhagens tumorais de GBM. Entretanto, não há diferença de citotoxicidade no co-cultivo com células tumorais de mama. Por fim, a análise de agrupamento por correlação evidenciou que o perfil de citocinas liberado no co-cultivo entre as células CAR-T co-cultivadas com GBM é distinto daquele do cultivo com células tumorais de mama, indicando resposta específica à presença dos antígenos GSCT2/T3.

Conclusões

Apesar de terem expressão variável, concluímos que os antígenos GSCT2 e GSCT3 são alvos com potencial para uso em imunoterapia com células CAR-T devido à sua expressão em diferentes tipos tumorais. Também demonstramos que o CAR GSCT2/T3, desenvolvido neste estudo, é eficientemente expresso em linfócitos primários humanos. Finalmente, o co-cultivo revelou que as células TCD3+CAR+ têm maior citotoxicidade e liberam um perfil distinto de citocinas em comparação com as TCD3+ controle.

Palavras-chave

Glioblastoma, células tronco-tumorais, CAR-T

Financiador do resumo

Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica (PIBIC) - CNPq